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阿爾茨海默病（Alzheimer's disease, AD），俗稱“老年癡呆癥"，是一種嚴重的神經(jīng)退行性疾病，患者通常會出現(xiàn)以記憶力衰退、學(xué)習(xí)能力減弱為主的癥狀，并伴有情緒調(diào)節(jié)障礙以及運動能力喪失，極大地影響個人、家庭乃至社會的發(fā)展。目前，全球約有5000萬人罹患AD。隨著人類平均壽命增長、老齡化社會加劇，AD患病率也將不斷上升，預(yù)計到2050年AD患者將增加至1.5億以上。已有研究表明AD發(fā)病與代謝性改變相關(guān)，且AD具有很強的遺傳性。目前仍缺乏預(yù)防或治療AD的有效方法。組織及細胞相關(guān)的各類光學(xué)成像技術(shù)的應(yīng)用有助于AD病理學(xué)特征檢查、揭示病因機制，從而探索開發(fā)新的治療策略。
以下將與大家分享徠卡THUNDER和MICA產(chǎn)品在研究AD星膠細胞功能障礙、易感基因機制中的應(yīng)用。
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應(yīng)用Leica Thunder Imager研究生物鐘核心組分CLOCK和BMAL1蛋白在AD星形膠質(zhì)細胞功能障礙中的作用機制
葡萄糖代謝的改變與AD的發(fā)病機制有關(guān)；星形膠質(zhì)細胞有氧糖酵解是腦能量代謝的重要代謝途徑；晝夜節(jié)律紊亂與阿爾茨海默病有關(guān)。本研究表明，AD患者大腦皮層受損星形膠質(zhì)細胞中CLOCK和BMAL1蛋白水平顯著升高。CLOCK和BMAL1的過表達通過降低人星形膠質(zhì)細胞中己糖激酶1 (HK1)和乳酸脫氫酶A (LDHA)蛋白水平顯著抑制有氧糖酵解和乳酸生成。此外，CLOCK和BMAL1的升高通過抑制膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)在人星形膠質(zhì)細胞中誘導(dǎo)功能損傷。此外，在人星形膠質(zhì)細胞中，CLOCK和BMAL1的升高通過激活caspase-3依賴性凋亡來促進細胞毒性。
01
樣本
從荷蘭腦庫中獲得3例AD患者的額葉皮質(zhì)、枕葉皮質(zhì)、顳葉皮質(zhì)和頂葉皮質(zhì)共12塊石蠟包埋腦組織。從Novus Biologicals公司(Minneapolis, MN, USA)獲得4個成人正常腦組織石蠟包埋塊，包括額葉皮質(zhì)(NBP2-77761)、枕葉皮質(zhì)(NBP2-77766)、顳葉皮質(zhì)(NBP2-77774)和頂葉皮質(zhì)(NBP2-77769)。
02
免疫熒光分析
石蠟包埋組織塊，制成4um厚度腦切片。切片在0.5% Triton-X (T8787, Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA))中滲透。在cas-block組化試劑(008120，Thermo Fisher)中封閉。然后用以下抗體染色:clock 1:100，(clock ab3517, Abcam， (Cambridge, UK))， bmal1 1:100，(NB100-2288, Novus Biologicals)，gfap 1:100，（#3670, Cell signaling technology）。二抗分別為山羊抗兔IgG (H+L) Alexa Fluor 488 (A11008, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)) 和山羊抗小鼠IgG H&L Texas Red (ab6787, Abcam (Cambridge, U.K.))，在25℃下作用2小時。使用DAPI，(F6057, Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)) 進行核染色。
03
成像
THUNDER Imager Tissue (Leica Microsystems) 對染色腦切片成像。采用LAS X圖像處理軟件(Leica Microsystems )和ImageJ軟件v1.52a (Bethesda, MD, USA)對染色腦切片進行定量。
圖1所示：在腦皮質(zhì)區(qū)受損的星形膠質(zhì)細胞中，患者的CLOCK和BMAL1水平升高。
(A)大腦皮層中CLOCK表達的代表性免疫熒光圖。AD或非AD的血管周圍(V)星形膠質(zhì)細胞標記GFAP(紅色)中的CLOCK(綠色)表達 (每組n = 3，每個受試者n = 6)，DAPI標記細胞核（藍色）。外表面(OS); 分子層 (ML); 外顆粒層 (EGL)。比例尺，20µm。(B)BMAL1在AD患者大腦皮層區(qū)域的表達 。血管周圍星形膠質(zhì)細胞標記物GFAP(紅色)， BMAL1(綠色)在星形膠質(zhì)細胞中表達(每組n = 3，每個受試者n = 6)。DAPI標記細胞核。C、D圖為A、B的統(tǒng)計結(jié)果。
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應(yīng)用Leica MICA 發(fā)現(xiàn)AD易感基因相關(guān)蛋白CD2AP存在于哺乳動物突觸中，并調(diào)節(jié)突觸的結(jié)構(gòu)和功能
AD易感基因的果蠅同源物CD2相關(guān)蛋白 CD2AP是突觸傳遞和蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)因子。缺乏CD2AP的小鼠存活至成年，行為正常，但血腦屏障完整性受損，導(dǎo)致對藥物誘導(dǎo)癲癇發(fā)作的易感性增加。在來源于大鼠小腦顆粒神經(jīng)元的原代培養(yǎng)中，Cd2AP敲低會破壞神經(jīng)元的生長。對細胞培養(yǎng)、果蠅和小鼠模型的進一步研究也表明，CD2AP與淀粉樣蛋白- β肽或tau蛋白之間可能存在相互作用，從而形成淀粉樣斑塊和神經(jīng)原纖維纏結(jié)。
01
樣本及免疫組化(IHC)：
培養(yǎng)神經(jīng)細胞的免疫組化：
吸走培養(yǎng)基，用相同體積溫的PFA 4% / 0.2M蔗糖/ 1 x PBS室溫孵育10分鐘，吸走，用相同體積的0.1% PBS-Triton孵育10分鐘，PBS-T換成了PBS洗，在2%山羊血清中室溫封閉1小時，然后在PBS + 1%山羊血清稀釋的一抗中孵育，4℃過夜。隨后PBS + 1%山羊血清中漂洗三次(室溫下15分鐘/次),在PBS + 1%山羊血清稀釋的二抗中孵育2小時，清洗，用DAPI Fluoromount-G固定。
所用抗體：
兔抗cd2ap(IHC為1:2000，定制的多克隆抗體)；雞抗map2(IHC為1:500 ,Abcam# ab5392)，小鼠抗neun (IHC為1:500,Sigma-Aldrich# MAB377)，小鼠抗psd95 (IHC為1:500，NeuroMab-UC Davis# 75-028)，豚鼠抗synapsin (IHC為1:250,Synaptic Systems# 106004)，分別與AlexaFluor 488、546、555和647熒光團結(jié)合(均為1:1000,Invitrogen)。
02
成像
使用Leica LAS X和徠卡MICA，配備10 /0.32 NA(干)，20 /0.75 NA(干)，或63 /1.20 NA(水)物鏡。所有免疫熒光圖像使用Imaris 9.7.2或FIJI 2.1.0/1.53c進行處理。
圖2. CD2AP染色在培養(yǎng)神經(jīng)元中的定位。(A) CD2AP (綠色)與神經(jīng)元標記物MAP2(洋紅色)。(B) CD2AP (綠色)染色也與Synapsin(紅色)。所有圖像均為培養(yǎng)野生型 (WT) DIV14小鼠皮層神經(jīng)元。
圖3. CD2AP在小鼠星形膠質(zhì)細胞中表達低。CD2AP (綠色)與星形膠質(zhì)細胞標記物GFAP (紅色)。細胞核 (DAPI，藍色) 和MAP2(洋紅色)也同時染色。所有圖像均為野生型 (WT)培養(yǎng)的DIV14小鼠皮層神經(jīng)元。
Thunder Imager以dute的zhuanliICC方法實時去除非焦面的模糊信號，在快速寬場成像的同時，獲得高清高分辨圖像。
MICA則以智能極簡方式通過zhuanlifluosync技術(shù)能實現(xiàn)真正的同時四色成像，并提供最佳活細胞條件。
徠卡顯微系統(tǒng)，見微知著，
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參考文獻：
1. Elevated CLOCK and BMAL1 Contribute to the Impairment of Aerobic Glycolysis from Astrocytes in Alzheimer’s Disease. Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 7862.
2. Alzheimer’s disease risk gene CD2AP is a dose-sensitive determinant of synaptic structure and plasticity. Human Molecular Genetics, 2024, 1–18.
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